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塑料培養(yǎng)皿的細胞分離與培養(yǎng)
塑料培養(yǎng)皿細胞分離對于培養(yǎng)貼壁細胞至關重要。胰蛋白酶消化是最流行的分離技術，盡管它由于對膜和細胞外基質的損害而降低了生存能力。避免這種損害將提高細胞培養(yǎng)效率。在這里，我們提出了一種無酶細胞分離方法，該方法利用聲壓從間歇行波中浸入無血清培養(yǎng)基中。與通過胰蛋白酶消化分離的細胞數(shù)量相比，此方法可分離96.2％的細胞，并在48小時內將其轉移產率提高至傳統(tǒng)方法的130％。我們顯示消除胰蛋白酶消化減少了細胞損傷，提高了分離細胞的存活率。施加到細胞的聲壓和間歇行波引起的介質晃動被認為是導致細胞脫離的最重要因素。該擬議的方法將通過更有效的轉移過程加快組織培養(yǎng)細胞的擴增，從而改善生物制藥生產。
細胞培養(yǎng)是許多生物技術應用的基礎，包括生物藥物的生產，生物蛋白質，組織工程和基因轉染。目前，約70％的生物藥物的開發(fā)都涉及哺乳動物細胞培養(yǎng)程序。藥品管道中生物藥品的數(shù)量正在迅速增加，并且在接下來的幾十年中，對生物藥品的需求預計還將增加。此外，對干細胞的研究，例如誘導性多能干細胞，導致它們在過去幾年中在組織工程中的臨床應用。這些努力突顯了對有效培養(yǎng)和提供大量這些細胞的日益增長的需求。
一種潛在的細胞分離方法是在細胞培養(yǎng)表面上使用溫度響應性聚合物。當溫度降低時，這些表面會迅速水合，變成親水性并引起自發(fā)的細胞釋放。該方法已經用于產生細胞片和組織。但是，該方法的主要缺點是必須在培養(yǎng)表面上使用溫度敏感的聚合物，該聚合物既昂貴又易于意外或過早釋放。此外，該方法需要受過訓練的熟練技術人員來使用它，這增加了成本 最后，由于這些材料需要大量處理以增強細胞粘附力和處理精度，因此到目前為止，它們尚未用于自動化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中。有效且無損傷的細胞分離問題仍然存在。
在這里，我們展示了一種無酶細胞分離方法，該方法利用了聲壓和由超聲換能器在臨床上普遍存在的細胞培養(yǎng)皿中形成的間歇性超聲行波引起的晃動。這種方法提供了一種不影響細胞生存力的細胞分離方法，因此可用于生物技術應用中的高效細胞培養(yǎng)。
有效生長培養(yǎng)有兩種細胞培養(yǎng)方法：單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。傳統(tǒng)上，細胞是在單層中培養(yǎng)的，其細胞粘附在平坦的表面上，需要在重新沉積和粘附之前通過酶分離以釋放細胞：細胞傳代。懸浮培養(yǎng)方法也已經用于研究中，盡管需要仔細監(jiān)測以控制例如懸浮培養(yǎng)產生的球體的尺寸。需要由于接觸抑制引起的粘附附聚和維持適當水平的氧氣,代謝物和信號分子。此外，懸浮培養(yǎng)中每個細胞所經歷的環(huán)境是不同的。球體外部的那些細胞受到攪動，化學物質快速變化以及營養(yǎng)物質流入和廢物提取流量的剪切作用，而球體內部的細胞都缺乏。這些差異導致異質性和壞死核心，肯定是代表實驗中實際組織行為所希望的，但是由于細胞培養(yǎng)整體質量的下降，在大規(guī)模培養(yǎng)細胞中存在問題。
結果，由于其易于處理，幾十年來，單層細胞培養(yǎng)一直是主要的方法，需要在塑料培養(yǎng)皿或燒瓶中播種，培養(yǎng)，分離和收集細胞。盡管其占主導地位，但該方法仍存在重大缺陷，但多年來卻很少有改進，特別是在細胞傳代方面。蛋白酶是一種切斷蛋白質中肽鍵的酶，當細胞從塑料培養(yǎng)皿或燒瓶中脫落時，負責細胞表面的破壞。胰蛋白酶是最重要的蛋白酶之一，因為它廣泛用于分離細胞的培養(yǎng)中，因此由于其對細胞膜的破壞而存在問題。流式細胞儀可用于通過減少細胞蛋白質來檢測這種損傷，這已被證明取決于細胞浸入胰蛋白酶溶液的時間。長時間的胰蛋白酶治療會延遲第一細胞分裂，并可能對貼壁細胞的增殖產生不利影響。胰蛋白酶處理的細胞可能會恢復其大多數(shù)表面蛋白，它們通常需要8-24小時才能恢復，但是胰蛋白酶消化后表達的某些蛋白是不可逆的。因此，無酶細胞分離方法對于繼續(xù)細胞培養(yǎng)更好。自動化的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)顯示出更高的培養(yǎng)效率，其操縱器可以處理細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶以及注射或抽吸溶液。這些自動化系統(tǒng)有助于提高播種，培養(yǎng)和收集過程的效率 ，盡管它們仍然采用胰蛋白酶，同時使用機器人進行機器人搖動和移液，仍然會損壞細胞。如果可能，無酶細胞分離方法可能會在改善細胞培養(yǎng)性能和質量方面提供實質性的好處。
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